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              1. 腦出血后CCR5激活通過CCR5/PKA/CREB途徑促進NLRP1依賴性神經元焦亡

                欄目:最新研究動態 發布時間:2022-02-15
                目前有研究探討了實驗性腦出血(ICH)后CCR5激活對神經元焦亡的影響以及涉及cAMP依賴的PKA /CREB /NLRP1通路的潛在機制......


                   神經元性焦亡是一種由促炎信號觸發的調節性細胞死亡。CCR5C-C趨化因子受體5)介導的炎癥參與各種神經系統疾病的病理過程。目前有研究探討了實驗性腦出血(ICH)后CCR5激活對神經元焦亡的影響以及涉及cAMP依賴的PKA /CREB /NLRP1通路的潛在機制。該研究202111月發表在《Stroke》,IF7.9.


                技術路線:


                主要研究結果:

                1.   腦出血后腦內CCR5的時空表達

                   采用ELISAWestern blot檢測腦出血后0、3、6、12、2472小時同側(右側)大腦半球CCL5、CCR5、PKACα、p-CREBNLRP1的表達。與Sham組相比,在3小時時檢測到CCL5水平顯著升高,經ELISA測定,24小時時CCL5水平相對較高。CCR5水平在腦出血后3小時顯著升高,在24小時達到峰值,并在72小時開始下降(圖1A)。腦出血后,CCR5的潛在下游蛋白PKACαp-CREB也以與CCR5相似的模式暫時升高。與Sham組相比,腦出血后6小時NLRP1炎癥體表達顯著上調,72小時達到峰值(圖1A)。雙免疫熒光染色顯示腦出血后24小時CCR5主要表達于同側基底皮質的神經元、小膠質細胞和星形膠質細胞(1B)。

                1  ICHCCL5、CCR5、PKA-Cα、p-CREB、CREBNLRP1蛋白水平的時空表達


                2.   
                MVC抑制CCR5可減輕腦出血后2472小時的神經行為缺陷

                   在ICH24小時,與Sham組相比,ICH+vehicle組有明顯的神經損傷(圖2A)。與載體治療ICH組相比,每天150450 μg/kg劑量的MVC治療在ICH24小時的改良Garcia試驗、前肢放置試驗和轉角試驗中顯著改善了神經功能(圖2A)。

                   根據這一結果,確定150μg/kg/天的劑量為MVC的最佳劑量,并在隨后的實驗中使用。與ICH+載體組相比,在ICH72小時,MVC治療顯著降低ICH小鼠的神經行為缺陷(圖2B)。相反,與ICH+載體組相比,ICH72小時首次給藥MVC并沒有顯著減少ICH小鼠的神經行為缺陷(圖2C)。

                2 MVCICH2472小時神經行為結果的影響


                3.   
                MVC介導的CCR5抑制降低了腦出血后24小時內神經元焦亡細胞的死亡

                        TUNEL染色和Fluoro-Jade C染色分別用于評估MVC治療是否減少了神經細胞死亡。在腦出血24小時后,用cleaved caspase-1標記的神經元核來評估神經元焦亡。腦出血后24小時,Sham組相比,腦出血大鼠的TUNEL陽性神經元和Fluoro-Jade C陽性變性神經元顯著增加(圖3A3B)。MVC介導的CCR5抑制顯著減少TUNEL陽性神經元和Fluoro-Jade C陽性退化神經元數量(圖3A3B)。與ICH+治療組相比,在ICH24小時,MVC治療顯著減少了血腫周圍區域cleaved caspase-1陽性神經元的數量(圖3C)。

                3 ICH24小時,用MVC抑制CCR5對神經元損傷、焦亡的影響


                4.      
                MVC改善了腦出血后的長期感覺運動協調、空間學習和參考記憶功能,并減少了海馬氨角1CA1)神經元的丟失

                       Sham組相比,ICH+載體組在足部缺陷試驗中有更多的左前肢足部缺陷,在ICH后的第一、第二和第三周,在rotarod試驗中下降的潛伏期更短(圖4A)。而MVC治療顯著減少了左側前肢的足部缺陷(圖4A),但增加了ICH小鼠的下降潛伏期(圖4A)。在Morris水迷宮實驗中,ICH+載體組的游泳距離和逃避潛伏期明顯長于Sham組。然而,與ICH+載體組相比,MVC治療顯著降低了第3-5區的逃避潛伏期和游泳距離(圖4A)。在探測象限試驗中,與Sham組相比,ICH+載體組在目標象限花費的時間更少。然而,與ICH+載體組相比,MVC治療顯著增加了在探測象限花費的時間(圖4A)。在ICH后第25天進行Nissl染色以評估海馬CA1區的神經元丟失。結果顯示,ICH+載體組海馬CA1區存活的神經元數量少于Sham組,但與ICH+載體組相比,MVC治療顯著增加了存活的CA1神經元數量(圖4B)。

                4 MVC改善了ICH后的長期神經行為功能


                5.   
                腦出血后24小時,CREB抑制劑逆轉MVC對神經行為缺陷和CCR5/PKA Cα/CREB/NLRP1介導的焦亡的神經保護作用

                         ICH24小時,用CREB抑制劑666-15預處理,可顯著逆轉MVC對改良Garcia、前肢放置和轉角測試的神經行為益處(圖5A)。此外,MVC顯著增加同側腦出血后腦組織中PKA-Cαp-CREB的蛋白水平,但降低NLRP1、ASC、C-caspase-1、N-GSDMD、IL-1βIL-18的表達(圖5B)。與MVC治療的ICH小鼠相比,666-15一致逆轉了MVC對細胞死亡和CCR5/PKA-Cα/CREB/NLRP1信號通路的影響,這與NLRP1、ASC、C-caspase-1、N-GSDMD、IL-1βIL-18的蛋白水平升高有關(圖5B)。

                5 666-15CREB的抑制消除了MVCICH小鼠的神經功能益處和抗神經性過敏作用


                6.   
                在注射rCCL524小時,通過rCCL5激活CCR5,通過CCR5/PKA Cα/CREB/NLRP1信號通路導致幼稚小鼠出現神經功能缺損和焦亡

                   側腦室注射rCCL5顯著降低了幼稚小鼠改良Garcia、肢體放置和轉角試驗的神經評分(圖6A),并導致同側腦組織中NLRP1、ASC、C-caspase-1、N-GSDMD、IL-1βIL-18的蛋白水平顯著升高(圖6B)。相反,與naive + rCCL5 +載體組相比,PKA激活劑8--cAMP通過顯著增加na?ve + rCCL5 + 8-Bromo-cAMPPKA-Cα的表達,逆轉了rCCL5的作用(圖6B)。

                6 rCCL5通過激活CCR5/PKA-Cα/CREB/NLRP1信號通路對幼稚小鼠的有害影響


                主要結論:

                該研究表明,小鼠實驗性腦出血后,CCR5激活至少部分通過CCR5/PKA/CREB信號通路促進NLRP1依賴性神經元焦亡和神經功能缺損。使用MVC抑制CCR5可能在ICH患者的治療中提供一種有希望的治療策略。


                參考文獻:

                Yan J, Xu W, Lenahan C, Huang L, Wen J, Li G, Hu X, Zheng W, Zhang JH, Tang J. CCR5 Activation Promotes NLRP1-Dependent Neuronal Pyroptosis via CCR5/PKA/CREB Pathway After Intracerebral Hemorrhage. Stroke. 2021, 52(12):4021-4032. doi: 10.1161/STROKEAHA.120.033285.


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