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    1. FAM171B通過穩定波形蛋白并增強CCL2介導的TAM浸潤促進膀胱癌進展

      欄目:最新研究動態 發布時間:2024-05-15
      膀胱癌是世界范圍內第二大常見的泌尿系統惡性腫瘤,嚴重威脅人類健康......

       

       

       

             膀胱癌是世界范圍內第二大常見的泌尿系統惡性腫瘤,嚴重威脅人類健康。膀胱尿路上皮癌(BLCA)是膀胱癌最常見的病理類型,占所有膀胱癌的90%。侵襲和轉移是膀胱癌患者預后不良的主要原因。雖然非肌層浸潤性膀胱癌很少發生轉移,但約有15-20%進展為肌層浸潤性膀胱癌。肌層浸潤性膀胱癌轉移風險高,5年生存率明顯低于非肌層浸潤性膀胱癌。免疫療法帶來了有希望的生存獲益,然而肌層浸潤性膀胱癌的治療仍然具有挑戰性,因其有較高的復發率。因此,深入了解膀胱癌進展的分子機制對于開發新的治療方法至關重要。

             上皮-間充質轉化(EMT)是驅動遠處轉移的主要機制,是膀胱癌患者死亡的主要原因。波形蛋白(VIM)是間充質細胞的關鍵標志物,在膀胱癌的生長、侵襲和不良預后相關。膀胱癌細胞EMT過程中波形蛋白表達上調,提示靶向波形蛋白有望成為阻止膀胱癌轉移進展的一種治療策略。腫瘤微環境(TME)由多種促進腫瘤進展的基質細胞組成。這些細胞中腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)構成了最豐富的免疫細胞群。TAMs是抗腫瘤免疫的主要障礙,是免疫治療失敗的關鍵因素。值得注意的是,趨化因子配體2(CCL2)在巨噬細胞募集中起關鍵作用,并參與癌細胞增殖、癌癥轉移和免疫抑制性TME的建立。了解CCL2在膀胱癌中持續表達的分子機制可以為開發有效的抗CCL2治療提供新的理論基礎。FAM171B是一種廣泛表達且進化保守的蛋白。在人結直腸癌細胞中,FAM171B被鑒定為miR-483-3p的功能靶點,參與調控奧沙利鉑耐藥。然而FAM171B的結構、功能和在癌癥中的具體作用的理解仍然有限。該研究發表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》,IF:12.658。

      技術路線

       

       

       

      主要研究結果

      1. FAM171B表達與BLCA患者腫瘤進展及M2 TAM浸潤呈正相關

             為了評估FAM171B在膀胱癌中的臨床意義,研究者利用TCGA數據庫、GEO數據庫和研究者的臨床中心的數據進行了全面的分析。首先,研究者分析了TCGA-BLCA隊列中19個腫瘤組織和匹配的癌旁組織的RNA測序數據。結果顯示,FAM171B在BLCA腫瘤組織中的表達水平高于配對的癌旁組織(圖1A)。隨后,研究者對包含70例BLCA患者臨床標本的組織微陣列進行免疫組織化學染色,以定量FAM171B蛋白表達。代表性圖像提供于圖1B中。根據從組織微陣列分析獲得的臨床信息和IHC染色結果,研究者確定了高FAM171B蛋白水平與晚期T分期和晚期N分期之間的顯著相關性(圖1C,D)。對TCGA數據庫中406例BLCA組織的RNA測序數據進行的分析獲得了一致的結果(圖1J-L)。這些結果提示,FAM171B表達水平升高與較晚期的臨床病理分級和分期相關。此外,研究者的預后分析表明,FAM171B蛋白水平升高的BLCA患者顯示出顯著較低的總生存(OS)率、無進展生存(PFS)率和疾病特異性生存(DSS)率(圖1E-G)。然而,無病生存(DFS)率的差異無統計學意義(圖1H)。為了驗證FAM171B在膀胱癌中的表達與生存率之間的關系,研究者使用了來自GEO數據庫的613例患者的完整隊列。結果表明,在該隊列中,FAM171B蛋白水平升高與較差的OS結局顯著相關(圖1I)。此外,對TCGA-BLCA隊列中的免疫細胞浸潤進行的分析表明,FAM171B表達與巨噬細胞浸潤的相關性最強(圖1M)。研究者進一步研究了影響單核/巨噬細胞的趨化因子表達與FAM171B的關系。在評估的趨化因子中,只有CCL2與FAM171B具有統計學顯著相關性(圖1N)。對于FAM171B與BLCA中巨噬細胞表型之間的關聯,基于QUANTISEQ算法的免疫分析顯示FAM171B表達與M2型巨噬細胞之間存在顯著的正相關(圖1P),而與M1型巨噬細胞之間沒有顯著的相關性(圖10)。在組織芯片中評估FAM171B與基質細胞浸潤的關系。代表性圖像如圖1Q所示。根據免疫組織化學染色結果,將所有樣本分為FAM171B高表達組和低表達組。通過多次免疫熒光分析,研究者發現FAM171B蛋白的表達水平與CD206+ M2巨噬細胞的浸潤顯著正相關,而與CD8+ T細胞的浸潤呈負相關。然而,在α-SMA+成纖維細胞浸潤方面,研究者沒有檢測到FAM171B高表達組和低表達組之間的顯著差異(圖1R)。綜上所述,研究者的研究結果表明,FAM171B與M2型巨噬細胞的浸潤相關,并可能作為膀胱癌的潛在預后指標。

       

       

      圖1 FAM171B表達與BLCA患者腫瘤進展及M2 TAM浸潤呈正相關

       

      2. FAM171B促進膀胱癌細胞的惡性表型

             Chronos依賴性評分顯示,在CCLE數據庫中28個人膀胱尿路上皮癌細胞系中,T24細胞系的評分最低,表明FAM171B在T24細胞中比在其他細胞系中更關鍵(圖2A)。除T24人膀胱尿路上皮癌細胞外,研究者還納入了MB49小鼠膀胱尿路上皮癌細胞。為了研究FAM171B在膀胱癌細胞中的分子功能,研究者在T24和MB49細胞中敲低和過表達FAM171B,并通過Western blot分析驗證其效率(圖2B)。CCK-8法檢測FAM171B對T24和MB49細胞活力的影響。兩個細胞系的結果表明,在96 h后,FAM171B過表達細胞的活力增加,而FAM171B敲低細胞的活力降低(圖2E)。此外,集落形成實驗結果表明,過表達FAM171B后,T24和MB49細胞的集落形成能力顯著增加,而敲低FAM171B導致集落形成能力下降(圖2C,D)。這些體外研究結果表明,FAM171B基因的表達影響細胞增殖,盡管細胞活力的差異僅在96小時后才變得有統計學意義。此外,研究者的目的是通過傷口愈合和transwell侵襲來闡明FAM171B對膀胱癌細胞轉移的影響。Transwell侵襲實驗結果顯示,與相應的對照組相比,敲低FAM171B的T24和MB49細胞組中下室的遷移細胞數量減少,而過表達FAM171B時,下室的遷移細胞數量增加(圖2F,G)。同樣,敲低FAM171B降低了T24和MB49細胞的傷口愈合效果。而FAM171B過表達顯著加速了細胞遷移(圖2H,I)。這些體外結果強烈表明FAM171B促進了膀胱癌細胞的惡性表型。

       

       

      圖2 FAM171B促進膀胱癌細胞的惡性表型

       

      3. RNA測序T24細胞以研究FAM171B的功能

             為了研究FAM171B在膀胱癌細胞中的作用,研究者對FAM171B過表達和對照T24細胞進行了RNA測序。樣本間相關性的熱圖表明,FAM171B過表達組和對照組之間的mRNA表達水平存在顯著差異,而各組內的差異相對較?。▓D3A)。通過對測序數據的分析,研究者確定了244個差異表達基因?;鹕綀D顯示了一些差異表達的基因;上調基因包括CDRT4、APLN和CCL2,下調基因包括RAB4B、CACNA1S和IL1A(圖3B)。此外,6個樣本的基因表達熱圖顯示,亞組間差異表達基因的表達存在顯著差異(圖3C)。為了進一步了解FAM171B在T24細胞中的具體功能,研究者進行了GO分析,KEGG分析和eggNOG分析。在T24細胞系中,GO分析顯示FAM171B與炎癥反應和細胞因子介導的信號通路等生物學過程顯著相關(圖3D)。在細胞成分類別中,FAM171B與細胞外間隙和過時的細胞外區域部分顯著相關(圖3E)。在分子功能方面,FAM171B與腫瘤壞死因子激活受體活性和細胞因子活性顯著相關(圖3F)。KEGG分析表明,FAM171B主要與IL-17信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用和TNF信號通路相關(圖3G)。此外,eggNOG功能分析顯示FAM171B主要參與信號轉導機制、復制、重組、修復和細胞骨架相關功能(圖3H)。綜上所述,RNA測序的結果全面揭示了FAM171B在人膀胱癌T24細胞系中的不同功能,表明其功能主要涉及細胞因子,信號通路轉導和細胞骨架相關過程。

       

       

      圖3 RNA測序T24細胞以研究FAM171B的功能

       

      4. 膀胱癌細胞中FAM171B與波形蛋白、HNRNPU相互作用

             為了闡明FAM171B在蛋白質水平上的分子作用,研究者通過免疫共沉淀和質譜鑒定了膀胱癌細胞中FAM171B的主要相互作用蛋白。使用DYKDDDDK磁珠從過表達標記FAM171B的T24細胞和對照細胞中收集含有FAM171B相互作用蛋白的上清液。隨后,利用質譜鑒定出特定的正相互作用蛋白(圖4A,B)。質譜鑒定出得分最高的相互作用蛋白如圖4C所示。利用STRING數據庫獲得FAM171B與其相互作用蛋白之間的相互作用。隨后構建FAM171B的蛋白相互作用網絡,如圖4D所示。其中評分最高的VIM和HNRNPU被鑒定為T24細胞中與FAM171B相互作用的關鍵蛋白。人類FAM171B蛋白的預測結構來自AlphaFold網站(圖4E)。為了進一步探索蛋白質之間的相互作用,研究者進行了模擬,以可視化FAM171B與波形蛋白和HNRNPU的對接模式(圖4J,L)。免疫熒光結果顯示FAM171B蛋白在T24細胞的細胞質和細胞核中均有表達(圖4F)。免疫熒光雙標染色和共定位分析驗證FAM171B與波形蛋白/HNRNPU的相互作用。雙重免疫熒光染色結果表明,FAM171B-波形蛋白復合體主要定位于細胞質(圖4G),而FAM171B- HNRNPU復合體主要定位于細胞核(圖4H)。Image J軟件共定位分析證實FAM171B與波形蛋白和HNRNPU存在空間共表達(圖4J,K)。綜上所述,這些發現強調了波形蛋白和HNRNPU是膀胱癌細胞中FAM171B的主要相互作用蛋白。

       

       

      圖4 膀胱癌細胞中FAM171B與波形蛋白、HNRNPU相互作用

       

      5. FAM171B通過穩定波形蛋白促進膀胱癌的進展

             波形蛋白是EMT的蛋白標記物,EMT是癌細胞獲得遷移和侵襲表型的過程。因此,研究者檢測了FAM171B對T24細胞EMT過程的影響。研究者觀察到FAM171B過表達的細胞中波形蛋白水平明顯升高,而FAM171B敲低的細胞中波形蛋白水平較對照組細胞降低。然而,在FAM171B過表達或敲低的T24細胞中,e-鈣黏蛋白和n-鈣黏蛋白的表達沒有顯著變化(圖5A)。此外,通過對組織芯片樣本的免疫組織化學染色分析,研究者發現FAM171B和波形蛋白的蛋白水平呈正相關(圖5K,L)。之前的結果表明FAM171B和波形蛋白在膀胱癌細胞中存在相互作用。蛋白質印跡分析表明,過表達FAM171B后的波形蛋白水平增加,可以通過Vimentin-IN-1(一種誘導波形蛋白降解的波形蛋白抑制劑)處理逆轉(圖5B)。為了研究FAM171B是否通過vimentin增強膀胱癌細胞的侵襲和遷移,研究者用Vimentin-IN-1處理細胞,進行劃痕實驗和transwell侵襲實驗。Transwell侵襲實驗結果表明,Vimentin-IN-1部分抑制了FAM171B過表達引起的T24細胞侵襲能力的增加(圖5C,D)。同樣,劃痕實驗結果表明,Vimentin-IN-1處理降低了FAM171B過表達引起的T24細胞遷移率的增加(圖5E,F)。鬼筆環肽染色結果表明,高效過表達FAM171B導致膀胱癌細胞的形態發生變化,從上皮形態轉變為間質形態(圖5G)。接下來,研究者使用CHX抑制膀胱癌細胞的蛋白質合成,隨后通過蛋白質印跡法檢測剩余的波形蛋白的水平。CHX處理10 h后,FAM171b過表達細胞的波形蛋白水平高于對照細胞(圖5H)。經過分析,研究者觀察到過表達FAM171B使內源性波形蛋白的半衰期從6 h延長到9 h,表明FAM171B可以穩定波形蛋白(圖5I)。隨后,研究者研究了FAM171B是否影響T24細胞中波形蛋白的泛素化。結果表明,FAM171B過表達導致波形蛋白泛素化水平降低,而FAM171B敲低導致泛素化水平升高(圖5J)。為了進一步驗證FAM171B/波形蛋白在體內的作用,研究者使用T24細胞建立了小鼠皮下異種移植模型(圖5M)。小鼠異種移植瘤的IHC染色分析表明,在OE-FAM171B組中FAM171B的表達顯著增加,證實了模型的成功建立(圖5N,R)。此外,FAM171B上調了體內波形蛋白的表達,這一作用被Vimentin-IN-1處理逆轉,與體外研究結果相似(圖5N,S)。而Vimentin-IN-1處理可有效緩解這一效應(圖5O,P)。此外,在小鼠體重方面,Vimentin-IN-1處理可部分緩解FAM171B過表達導致的體重下降(圖5Q)。綜上所述,這些結果證實了FAM171B在體內外通過穩定波形蛋白促進膀胱癌的進展。

       

       

      圖5 FAM171B通過穩定波形蛋白促進膀胱癌的進展

       

      6. FAM171B通過HNRNPU調控CCL2,促進膀胱癌中TAM的遷移和浸潤

             研究者進行體內和體外實驗,研究FAM171B和HNRNPU對膀胱癌細胞CCL2表達的影響。ELISA結果顯示,在MB49小鼠膀胱癌細胞中,過表達FAM171B增加了CCL2的分泌,敲低FAM171B減少了CCL2的分泌(圖6A)。RIP實驗結果證實了MB49細胞中HNRNPU與CCL2前體RNA的結合(圖6B)。與之前的研究結果一致,在MB49細胞中敲低HNRNPU可以增加CCL2前體RNA的水平并降低CCL2 RNA的水平(圖6C)。ELISA結果也證實,敲低HNRNPU降低了MB49細胞中CCL2的分泌(圖6D)。為了研究FAM171B和HNRNPU是通過共同途徑還是不同途徑影響CCL2分泌,研究者在FAM171B過表達的MB49細胞中分別進行了HNRNPU敲低干預或CCR2抑制劑處理(圖6E)。ELISA結果顯示,敲低HNRNPU減弱了FAM171B過表達引起的CCL2分泌增加(圖6F)。CCL2是誘導單核細胞和巨噬細胞特異性趨化的眾所周知的趨化因子。為了探討FAM171B和HNRNPU對巨噬細胞趨化的影響,研究者將RAW264.7小鼠巨噬細胞與不同分組的MB49小鼠膀胱癌細胞共培養。趨化實驗結果表明,在共培養系統中,FAM171B過表達增強了巨噬細胞對腫瘤細胞的趨化,而HNRNPU敲低和CCR2抑制部分減弱了這一作用(圖6G,H)。為了進一步驗證FAM171B/CCL2調控在體內的作用,研究者使用MB49膀胱癌細胞建立了小鼠皮下移植瘤模型(圖6I)。免疫組化分析(圖6J,O)和流式細胞術(圖6K,P)結果證實,FAM171B過表達顯著增加了腫瘤組織中的巨噬細胞浸潤,而CCR2抑制劑治療有效抑制了這一作用。重要的是,CCR2抑制劑還部分逆轉了FAM171B過表達引起的腫瘤生長增加(圖6L,M),并減輕了體重減輕(圖6N)。綜上所述,這些實驗表明FAM171B通過HNRNPU促進CCL2分泌,從而導致巨噬細胞浸潤和腫瘤進展。

       

       

      圖6 FAM171B通過HNRNPU調控CCL2,促進膀胱癌中TAM的遷移和浸潤

       

      7. FAM171B通過調控CCL2的表達增強TAM向M2表型的極化

             研究者使用雙重免疫熒光染色和流式細胞術在體內和體外研究FAM171B/CCL2調節對膀胱癌相關巨噬細胞極化的影響。流式細胞術分析顯示,與對照組相比,與過表達FAM171b的MB49細胞共培養時,CD206陽性的RAW264.7巨噬細胞比例增加。敲低HNRNPU和CCR2抑制劑的處理部分逆轉了FAM171B過表達誘導的CD206陽性的增加(圖7A,B)。在IHC中,研究者使用了另一種M2巨噬細胞標志物Arg1,并獲得了類似的結果(圖7C,D)。此外,研究者觀察到在共培養系統的培養基中,EGF和IL-10的分泌顯著增加,這兩種標志物都是M2巨噬細胞的標志物。有趣的是,THP-1來源的巨噬細胞與過表達FAM171b的T24細胞共培養后,其聚集性增強。為了進一步驗證FAM171B和CCL2在體內的作用,研究者檢測了小鼠移植瘤中M2型巨噬細胞的比例。與體外實驗結果一致,小鼠FAM171B過表達組皮下腫瘤中M2型巨噬細胞的比例增加,CCR2抑制劑處理顯著逆轉了FAM171B過表達的這一作用(圖7G-J)。綜上所述,這些實驗結果證實了FAM171B具有通過CCL2通路促進TME中TAM的M2極化的能力。

       

       

      圖7 FAM171B通過調控CCL2的表達增強TAM向M2表型的極化

       

      結論

             研究者發現FAM171B是一個有效的促進膀胱癌進展的因子,并且與晚期癌癥分期和不良預后呈正相關。此外,FAM171B通過與波形蛋白相互作用,增強其穩定性,發揮穩定作用,導致腫瘤進展。此外,FAM171B通過與HNRNPU相互作用增強CCL2 mRNA的剪接,最終導致TAM的募集并向M2表型極化?;谘芯空叩木C合研究結果,FAM171B作為膀胱癌診斷和治療干預的生物標志物具有巨大的潛力。

      機制圖

       

       

       

      實驗方法

      TCGA和GEO數據的生物信息學分析,細胞培養,轉染,細胞增殖測定和集落形成測定,鬼筆環肽染色,RNA 免疫沉淀(RIP),qRT-PCR,蛋白質印跡,免疫熒光染色(IF),免疫組織化學染色(IHC),HE染色,免疫共沉淀,流式細胞術,ELISA,傷口愈合試驗,transwell侵襲試驗,RNA測序、數據處理和基因差異分析,動物實驗,小鼠異種移植腫瘤模型

      參考文獻

      Hu WM, Li M, Ning JZ, Tang YQ, Song TB, Li LZ, Zou F, Cheng F, Yu WM. FAM171B stabilizes vimentin and enhances CCL2-mediated TAM infiltration to promote bladder cancer progression. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Nov 2;42(1):290. doi: 10.1186/s13046-023-02860-5.


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